蛋白的纯化

来源:互联网 编辑:李元芳 手机版

在进行任何一种蛋白质纯化的时候,都要时刻注意维护它的稳定性,保护它的活性,有一些通用的注意事项需要牢记,它们包括:1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。2、不要太稀,蛋白浓度维持在μg/mL~mg/mL。3、合适的pH,除非是进行聚焦层析,

第二部分:蛋白的纯化

见http://zhidao.baidu.com/question/292063616.html或 镍柱分离纯化 固定金属离子亲和柱主要用于金属螯化离子。位于许多蛋白中的组氨酸残基将会和许多金属离子,例如锌。铜,镍,铁等形成复合物。因此,该柱料能选择性螯合一些具有组氨酸残基的

如何区分蛋白表达在上清还是包涵体?

分离蛋白质混合物的各种方法主要是根据蛋白质在溶液中的以下性质:1)分子大小;2)溶解度;3)电荷;4)吸附性质;5)对其它分子的生物学亲和力等进行分离. 常见的分离提纯蛋白质的方法有:1、盐析与有机溶剂沉淀:在蛋白质溶液中加入大量中性

破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀,表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中,还有可能是二者中都有分布。

一、仪器设备 色析管柱 (Pharmacia C column, 1.6×100 cm)、铁架、铁夹及水平仪;部分收集器(fraction collector, 需准备干净试管约100 支);浓缩用离心机 (低速5,000 rpm);浓缩用离心管Centriprep-30 (Amicon 4322) 请注意其使用方法

根据我们实验室的经验,超声碎菌之后,如果菌液比较清亮,沉淀比较少,那表达的蛋白基本上是可溶的。但如果超声完之后, 菌液是浑浊的,而且当离心之后,离下的沉淀比较多,而且沉淀的颜色也比较白,那基本上就是包涵体了。包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成 的无活性的蛋白质聚集体,难溶于氺,可溶于变性剂如尿素,盐酸胍等,其实,包涵体也就是我们常说的不可溶蛋白。对于后者,可将上清和沉淀分别跑一个

麦芽糖结合蛋白与亲和填料结合了,当存在高浓度的麦芽糖的时候,麦芽糖会和麦芽糖结合蛋白相互竞争亲和填料,麦芽糖结合蛋白肯定竞争不过,就被洗脱下来了。

PAGE,看看上清中的量能达到多少,对于某些蛋白来说,一部分是以包涵体形式表达,一部分是以可溶的形式表达,而且量也不少,可以满足后续实验的需要,这个时候最好是纯可溶的,因为包涵体即使最后复性,活性也不太可信。

我觉得题主是想问改变性格中某些自己觉得不好的点吧。首先我觉得改变是有可能的,生活中会因为家庭,所处社会环境,经历的不同性格的某些点会慢慢改变。比如我自己性格内向,但是我现在也乐于与人交流,可以和陌生人自如的聊天说话。其次,我觉得要学会接纳自己的弱点,因为没有真正的完美。每个性格都有自己不好的一点。如果只是觉得性格某一点不好。我觉得其实你所在的圈子不适合。这样要么换个圈子,要么就是把这个点稍微改变一点点。举个??子,我自己就是内向性格,喜欢安静,喜欢独处。但是因为工作和社会需要去社交,那我就只是把原来的拒绝和陌生人说话一点改变了一下下而已。说的有点啰嗦,在地铁上看到这个问题就随手说下自己的观点和

对于沉淀跑SDS-PAGE,如何处理,用什么使其溶解,还有在大肠杆菌中表达的蛋白,在提取过程中,使用什么蛋白提取缓冲液。

比利时马林诺斯犬,又称比利时马里努阿犬,马犬,无论智商、灵活性、服从性、可训性都胜过其它工作犬,尤其是它的弹跳爆发力更是令人吃惊,好的马犬可以爬树,越过3米高墙轻而易举!而且对主人绝对忠诚。目前美国、德国、澳大利亚、中国等国家的军警界均已认识到这一点,并开始引进普及。马犬是一种不极其凶猛而又可以更好的保护主人的犬类,听从主人的命令,只要主人一声令下,他可以不顾一切的尽可能的完成主人下达的命令。而且有很多人喜欢把遛它当做一种运动训练当做一种乐趣生活中当它是一个伴侶。常言说的好,喜欢者百看不厌,不喜欢者看见就烦。价格方面:差点300,1000般10002000左右点2000N万普通:1200-16

沉淀用Buffer B重悬,(组成:8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀(湿重)加5ml Buffer B,使其充分溶解(可以放在微量震荡器上震荡20min),然后室温下12000转离心20min,留上清,弃沉淀。

看了这么多回答,感觉没有特别靠谱的。以前钓过无数的鱼给猫吃。根据个人的观察。猫吃鱼不会特别挑刺。大鱼小鱼的吃法不同。鱼体直径小于猫喉咙的,直接整条吞下去,鱼体直径大于喉咙小于猫嘴的,猫会像嚼甘蔗一样一段一段嚼碎了咽下去。这样吃下去的鱼,过一段时间,猫会把鱼鳍鱼刺鱼鳞什么的,都呕吐出来。比猫嘴更大塞不进嘴里去的鱼,是从侧面吃肉,就像人吃鱼一样,最后会剩下一条中间的鱼骨头,肌间刺什么的都吃下去了。猫肠胃的反吐功能很强的,胃里面有各种容易卡住的东西,鱼刺鱼骨头毛球什么的,都会吐出来。

取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液,就可以跑PAGE了。

人生就是一场修行,不管你是谁,总有你的道在等着你,你将以你的方式度过你一生。但是对于潜心修行的人来说,只有参悟真义才能功德圆满。如果你修满这七个阶段,那么大道离你就不远了!第一阶段:敬信修道者必须有坚定的信仰,正所谓“信者,道之根,敬者,德之蒂。根深则道可长,蒂固则德可茂。”只有怀着十分的恭敬心和坚定不移的信心才能在修道过程中长持本性,不迷失自我,离魔近道。同样,一个人不管做什么事情,工作也好,学习也罢,带着信仰前行,才能保持斗志,才能持之以恒地去做好每件事。第二阶段:断缘司马承祯说:“断缘者,断有为俗事之缘也。弃事,则形不劳;无为,则心自安。恬简日就,尘累日薄,迹弥远俗,心弥近道,至圣至神,

无 论是纯可溶蛋白还是包涵体,在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer(组成:10mM咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体(湿重)加2-5ml Lysis Buffer,充分悬起后,加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。

包涵体,简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的,主要的是疏水作用。实际上就是很多个蛋白分子,这些蛋白并不是交联在一起的,用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性,解聚。

电泳检测的话,可以用SDS-PAGE检测,在上样之前,需要用上样缓冲液处理样品,处理后,包涵体也就解聚了,每个蛋白分子与SDS结合,形成了可溶物。

包涵体是不容易破碎的,超声可以破碎菌体释放里面的包涵体,但是不能破碎包涵体;但如果用水煮的话,包涵体会变性,会有一部分可溶于水,所以你跑的上清中有可能有包涵体存在,也有可能没有包涵体;

建议:

还是先将菌体超声破碎,然后离心,取沉淀和上清再跑一次电泳,如果沉淀上清中都有你要的蛋白,说明表达的结果是部分可溶;如果仅上清有就是可溶性表达;如果仅沉淀中有,就是完全包涵体了。不过,一般情况下,应该是第一者的可能性大。

包涵体的纯化(一)

对于表达在包涵体内的蛋白,可以通过降低诱导温度(可以试试4度诱导过夜)和IPTG的量,降低蛋白的表达速度,从而减少包涵体形成的速度,增加正确折叠蛋白的量等来使目的蛋白不表达在包涵体内达到可溶性表达。但一般用pET28作为表达质粒且蛋白表达量较大时易形成包涵体。

包涵体:包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集,形成无活性的固体颗粒。

包涵体的组成与特性:

一般含有50%以上的重组蛋白,其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等,环状或缺口的质粒DNA,以及脂体、脂多糖等,大小为0.5-1um,难溶于水,只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

包涵体的形成:

主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子,或环境不适,无法形成正确的次级键等原因形成的。

1、表达量过高,研究发现在低表达时很少形成包涵体,表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快,以至于没有足够的时间进行折叠,二硫键不能正确的配对,过多的蛋白间的非特异性结合,蛋白质无法达到足够的溶解度等。

2、重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体,而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。

3、重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类,致使中间体大量积累,容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。

包涵体表达的有利因素:

1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击,包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。

2、降低了胞内外源蛋白的浓度,有利于表达量的提高。

3、包涵体中杂蛋白含量较低,且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离,有利于分离纯化。

4、对机械搅拌和超声破碎不敏感,易于破壁,并与细胞膜碎片分离。

菌体破碎一般采用:

a 超声波处理法:用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂。此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施(超声时置于冰上),超声功率、超声间歇时间、超声时间可以自己调整,超声完全了菌液应该变清亮(5-10分钟)。

b反复冻融法:将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。

c化学处理法: 细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理.

●必要时可将三种方法结合起来使用以使菌体充分破碎

在这我们以100 ml菌液为例:(此纯化方法可于室温中进行)

诱导表达

1 挑取含有重组质粒的菌落,接种于5 ml加有相应抗生素的LB培养基中,37℃振荡培养过夜。

2 以1%的接种量转接到100 ml加有相应抗生素的LB培养基中,37℃振荡培养至OD600=0.6-1.0,先取出300 μl诱导前的菌液,作为对照。再向锥形瓶中加入IPTG至终浓度为1mmol/L,37℃继续培养3-4 h。

3 取300μl经诱导后的菌液于EP管中,连同诱导前的菌液一起12,000 rpm离心1min后,将上清置于一个新的Eppendorf管中,细胞沉淀用等同于上清体积的ddH2O悬浮,分别制样。(以80μl样品为例,需加20μl 4×loading buffer,8μl 1M的DTT,52μl上清或沉淀悬浮液)

Ni2+亲和柱的制备

1 颠倒混匀固化的Ni2+树脂,取1ml装入层析柱。树脂自然沉降。

2 用3倍柱体积无菌水冲洗树脂。

3 用6倍柱体积1X Binding Buffer(包含6 M 尿素)洗柱,放置待用(4℃)。

包涵体纯化 (参照Novagen的纯化protocol)

1 以10,000 × g 离心10 min收菌后去上清。重悬菌体于40 ml 1X Binding Buffer 。

2 超声破碎细胞至菌液应该变清亮。

3 以5,000 × g 离心15 min收集包涵体和细胞碎片。

4 去上清后重悬于20 ml 1X Binding Buffer。

5 超声破碎至悬液应该变清亮。

(在第五步之前可加溶菌酶处理或反复冻融几次以促使菌体破碎。)

6. 以5,000 × g 离心15 min后将沉淀重悬于5 ml 1X Binding Buffer(包含6 M 尿素)并加蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为1mmol/L 。

7 放置冰上1 h 以完全溶解蛋白后以16,000 × g离心30 min去除不溶物质。并将上清在用Ni2+亲和柱纯化之前用0.45-μm 的滤膜过滤。

纯化带组氨酸的重组蛋白

1 将过滤后的样品上柱,使流速降低以使样品与Ni2+树脂充分结合。

2 再用十倍体积的1X Binding Buffer(包含6 M 尿素)过柱。

3 用1X Wash Buffer(包含6 M 尿素)洗柱。至流过液A280<0.01且基本保持水平。(大约1~2h)

4 用1X Elute Buffer(包含6 M 尿素)结合的蛋白,并开始收集样品(1ml/管),直至A280又恢复至基准线。收集的蛋白SDS-PAGE检测蛋白纯度。

纯化蛋白的透析和冻干

1 透析袋预处理:用10mmol/L NaHCO3,1mmolEDTA煮沸透析袋30min;再用ddH2O煮10min。

2 将蛋白溶液移入透析袋。

3 将其放入10倍体积以上的含3 M 尿素的去离子水中,用磁力搅拌器搅拌,于4℃透析。透析液中的尿素浓度以3 M—1.5 M—0.75M—0M 递减。

4 透析完成后将蛋白质溶液离心取上清,每500μl分到一个1.5mlEP管中,于真空冻干机(MAXI Dry Lyo)中冻干。冻干的蛋白溶于PBS,SDS-PAGE检测蛋白纯度和降解程度。

5 用完的透析袋用去离子水洗净并煮沸10min,于20%乙醇中保存。

Ni2+亲和柱的后处理和重生

1 纯化完毕后,Ni2+柱用去离子水过柱1~2h,再用20%乙醇过柱1~2h。

2 为保证亲和柱的活性,可进行再生

先用下列试剂依次冲洗层析柱:2倍体积的6mol/L盐酸胍,0.2mol/L乙酸;5倍体积水;2倍体积2%SDS;1倍体积25%、50%、75%乙醇;5倍体积乙醇;1倍体积75%、50%、25%乙醇;1倍体积水;5倍体积100mmol/L EDTA;1倍体积水。再用小于2倍体积的0.1mol/L NiSO4溶液再生,用水洗,最后用平衡缓冲液平衡。

8X Binding Buffer (8X = 4 M NaCl, 160 mM Tris-HCl, 40 mM imidazole, pH 7.9)

8X Wash Buffer (8X = 4 M NaCl, 160 mM imidazole, 160 mM Tris-HCl, pH 7.9)

4X Elute Buffer (4X = 4 M imidazole, 1 M NaCl, 80 mM Tris-HCl, pH 7.9)

加入尿素的溶液需现配现用。此外1X Wash Buffer中的咪唑浓度为20~60 mM,在实验中可依不同情况加以调节。

包涵体复性问题注意:

在有的复性过程中有蛋白沉淀析出,有建议表示:甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用(透析液中加入了1%的甘氨酸和5%的甘油,有一定的助溶效果)。低分子化合物脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等,在非变性浓度下是很有效的促进剂,都可阻止蛋白聚集;Tris对蛋白质复性有促进作用;EDTA可以防止蛋白降解对于包涵体复性,一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始,到2M 左右时结束。此外复性过程蛋白浓度不宜过大,一般为0.1-0.2mg/m。

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蛋白的表达与纯化

蛋白表达纯化已经是非常经典简单的实验了,没有LSS说的那么吓人。

说说我的蛋白表达纯化以及下面的单抗制作工作总体设计概要吧:

1 首先要知道你要纯化蛋白的编码DNA序列,查阅相关文献,看目的基因在那些细胞或者组织中高表达,进而设计该基因的引物,扩增出目的DN*段的ARF。这一布叫目的基因片段的获取

2 构建表达载体:根据你获得的基因本身的特性确定原核或者真核载体中表达,这一步的主要问题就是构建带有目的基因的质粒,导入表达系统中。一般原核表达时间短,成本低,表达量大,常优先考虑;但是有些基因在E coli中就是表达不出,可能是密码子优化等出现问题,也或者是由于想纯化得到更好的活性蛋白的考虑(原核的蛋白折叠系统显然没有真核的好),有很多研究者选择在毕赤酵母中表达。(我手里就有相关资料,因为以前做过表达纯化及后来的单抗制备),这一步再强调一下,优化密码子对于蛋白的成功表达很重要

3 载体构建好了,下面就是重组蛋白的表达了。这一过程涉及到用多少的诱导剂,诱导多少时间才能得到最多的蛋白的问题,即优化表达条件。就是在上述不同量诱导剂诱导条件下,取菌体上清(分泌型)或者破碎细胞(胞内表达的蛋白)电泳,看是否得到目的分子量大小的蛋白

4 蛋白表达成功,下面是根据蛋白质本身亲水/疏水,电荷带电特性等确定蛋白纯化的方法。一般步骤:离心,取蛋白所在的相

如果是分泌表达的蛋白,则取上清,超滤,没有超滤仪器可以用透析袋等代替,用离子交换柱层析。基本上这一步能得到纯化的95%的蛋白,电泳鉴定基本不会看到有杂带出现。如果还是纯度不符合要求,可以在表达蛋白最初在构建表达载体质粒的时候在蛋白的ORF后面加上HIS-标签,这样得到的蛋白不但可以用于HIS柱的进一步纯化,在不确定自己的融合蛋白是否有表达的时候,也可以单单用抗HIS的抗体做一WB,分析确认目的蛋白是否表达,这是蛋白表达的常用手段。

5 经过纯化后的蛋白仍然含有一部分无机盐,如果需要的话可以将蛋白经真空冻干机冻干,得到纯蛋白。

我们实验室做出来的一个蛋白,编码序列GC含量高75达%,但是功夫不负有心人,只要你想做那件事情,积极的寻找解决问题的手段,总会搞定的,没有跨不过的坎。如果坎太宽,搭桥解决总行。

蛋白质分离提纯方法

1、盐析法:

盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中,溶解度会随盐浓度的增高而上升,但当盐浓度增高到一定数值时,使水活度降低,进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和,水化膜逐渐被破坏,最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。

2、有机溶剂沉淀法:

有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二:其一、与盐溶液一样具有脱水作用;其二、有机溶剂的介电常数比水小,导致溶剂的极性减小。

3、蛋白质沉淀剂:

蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用,常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。

4、聚乙二醇沉淀作用:

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。

扩展资料:

吸附层析

1、吸附柱层析

吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相,以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。

2、薄层层析

薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相,以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层,然后按纸层析操作进行展层。

3、聚酰胺薄膜层析

聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。

层析时,展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程,就能导致分离物质达到分离目的。

为什么要对蛋白质纯化

因为我们通常得到的蛋白初级都是由菌体发酵而来的,得到的蛋白多是有很多杂蛋白(可以通过SDD-PAGE电泳直接看到),所以对于我们需要的目的蛋白需要通过具体的纯化过程,蛋白的纯化也是根据目的蛋白的特性来进行具体纯化,通常有离子交换,亲和等。如果目的蛋白含有标签蛋白还可以通过金属螯合层析纯化。从而得到比较纯的,也就是电泳中比较单一的条带蛋白。便于我们对此目的蛋白进行定性的分析与测定。

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